Context-dependent expression of a conditionally-inducible form of active Akt.

Araştırma özeti

Kaynak özetin Türkçe makine çevirisi. Klinik kullanım öncesinde özgün yayınla karşılaştırılmalı; hekim incelemesi değildir. cc by

Akt kinazları proliferasyon-yetenekli ve post-mitotik hücrelerde anahtar sinyal bileşenleridir. Burada, hem in vitro hem de in vivo uygulamaları için şartlı olarak indüklenebilir bir aktif Akt formu oluşturmaya çalıştık. E. coli dihydrofolate reductase'den türetilen ligand-yanıtlı Dengesizleştirici Alan (DD)'yi, Akt1, Akt(E40K)'ın kurucu aktif mutant formuna kaynaştırdık. Önceki çalışmalar, bu tür füzyon proteinlerinin bir ligand, Trimethoprim (TMP) antibiyotik tarafından stabilize edilebileceğini ve indüklenebileceğini göstermiştir. TMP tarafından nöronlar da dahil olmak üzere kültürdeki çeşitli hücresel arka planlarda doza bağlı, hem toplam hem de fosforile edilmiş / aktif DD-Akt (E40K) indüksiyonunu gözlemledik. Bir Akt substratı olan FoxO4'ün fosforilasyonu, DD-Akt (E40K) indüksiyonundan sonra önemli ölçüde yükselmiş ve indüklenen proteinin işlevsel olarak aktif olduğunu göstermiştir. İndüklenen Akt (E40K) hücreleri serum yoksunluğundan uyandırılan apoptozdan korudu ve Parkinson hastalığının iki hücresel modelinde (6-OHDA ve MPP+ maruziyeti) nöroprotektifti. İndüksiyon olmadan önemli bir koruma yoktu. Ayrıca AAV1 adeno ilişkili viral vektör aracılığıyla nöronal doğumdan sonra fare substantia nigra ve striatumda TMP tarafından Akt (E40K) indüksiyonunu değerlendirdik. Striatumda önemli indüksiyon olsa da substantia nigrada belirgin indüksiyon yoktu. Bu farkın olası temelini araştırmak için, kültürlü ventral orta beyin nöronlarında DD-Akt (E40K) indüksiyonunu inceledik. Kültürlerdeki hem dopaminerjik hem de dopaminerjik olmayan nöronlar, TMP tedavisinden sonra DD-Akt (E40K) indüksiyonunu gösterdi. Bununla birlikte, bazal DD-Akt (E40K) ekspresyonu dopaminerjik nöronlar için 3 kat daha yüksekti ve bu popülasyonda TMP tarafından önemli ölçüde daha düşük bir indüksiyon ile sonuçlandı. Bu tür bulgular, dopaminerjik nöronların, in vivodaki belirgin DD-Akt (E40K) indüksiyon eksikliği ve Parkinson hastalığındaki seçici kırılganlıklarıyla ilişkili olabilecek bir özellik olan protein bozulmasında nispeten verimsiz olabileceğini göstermektedir. Özetle, akt'ın indüklenebilir, biyolojik olarak aktif bir formunu oluşturduk. Uyuşmazlık derecesi, bu ve ilgili reaktifler için en uygun uygulamaları bildirecek hücresel bağlamı yansıtıyor gibi görünmektedir.

Özgün kaynak özetini okuyun

Akt kinases are key signaling components in proliferation-competent and post-mitotic cells. Here, we sought to create a conditionally-inducible form of active Akt for both in vitro and in vivo applications. We fused a ligand-responsive Destabilizing Domain (DD) derived from E. coli dihydrofolate reductase to a constitutively active mutant form of Akt1, Akt(E40K). Prior work indicated that such fusion proteins may be stabilized and induced by a ligand, the antibiotic Trimethoprim (TMP). We observed dose-dependent, reversible induction of both total and phosphorylated/active DD-Akt(E40K) by TMP across several cellular backgrounds in culture, including neurons. Phosphorylation of FoxO4, an Akt substrate, was significantly elevated after DD-Akt(E40K) induction, indicating the induced protein was functionally active. The induced Akt(E40K) protected cells from apoptosis evoked by serum deprivation and was neuroprotective in two cellular models of Parkinson's disease (6-OHDA and MPP+ exposure). There was no significant protection without induction. We also evaluated Akt(E40K) induction by TMP in mouse substantia nigra and striatum after neuronal delivery via an AAV1 adeno-associated viral vector. While there was significant induction in striatum, there was no apparent induction in substantia nigra. To explore the possible basis for this difference, we examined DD-Akt(E40K) induction in cultured ventral midbrain neurons. Both dopaminergic and non-dopaminergic neurons in the cultures showed DD-Akt(E40K) induction after TMP treatment. However, basal DD-Akt(E40K) expression was 3-fold higher for dopaminergic neurons, resulting in a significantly lower induction by TMP in this population. Such findings suggest that dopaminergic neurons may be relatively inefficient in protein degradation, a property that could relate to their lack of apparent DD-Akt(E40K) induction in vivo and to their selective vulnerability in Parkinson's disease. In summary, we generated an inducible, biologically active form of Akt. The degree of inducibility appears to reflect cellular context that will inform the most appropriate applications for this and related reagents.

Bilimsel değerlendirme

Araştırma sorusu

Sorunun kapsamı orijinal çalışma üzerinden değerlendirilir.

Yöntem ve örneklem

Çalışma tasarımı ve örneklem için kaynak makaleyi kontrol edin.

Temel bulgular

Bu kayıt için editoryal olarak onaylanmış bulgu özeti henüz yayımlanmadı.

Sınırlılıklar

Sonuçların genellenebilirliği, yanlılık ve klinik anlamı ayrıca incelenmelidir.

Bibliyografik veriden yöntem, örneklem veya klinik sonuç çıkarımı yapılmaz.