Konformasyona özgü ⁇ -sinüklein antikorları ne kadar spesifiktir? Farklı yapılar ve morfolojiye sahip ⁇ -sinüklein monomer, fibril ve oligomerlerin iyi karakterize edilmiş preparatlarını kullanarak 16 ⁇ -sinüklein konformasyonuna özgü antikorların karakterizasyonu ve doğrulanması.

Araştırma özeti

Aşağıdaki metin kaynak makalenin lisansı doğrulanmış orijinal özetidir. cc by

Increasing evidence suggests that alpha-synuclein (α-syn) oligomers are obligate intermediates in the pathway involved in α-syn fibrillization and Lewy body (LB) formation, and may also accumulate within LBs in Parkinson's disease (PD) and other synucleinopathies. Therefore, the development of tools and methods to detect and quantify α-syn oligomers has become increasingly crucial for mechanistic studies to understand their role in PD, and to develop new diagnostic methods and therapies for PD and other synucleinopathies. The majority of these tools and methods rely primarily on the use of aggregation state-specific or conformation-specific antibodies. Given the impact of the data and knowledge generated using these antibodies on shaping the foundation and directions of α-syn and PD research, it is crucial that these antibodies are thoroughly characterized, and their specificity or ability to capture diverse α-syn species is tested and validated. Herein, we describe an antibody characterization and validation pipeline that allows a systematic investigation of the specificity of α-syn antibodies using well-defined and well-characterized preparations of various α-syn species, including monomers, fibrils, and different oligomer preparations that are characterized by distinct morphological, chemical and secondary structure properties. This pipeline was used to characterize 18 α-syn antibodies, 16 of which have been reported as conformation- or oligomer-specific antibodies, using an array of techniques, including immunoblot analysis (slot blot and Western blot), a digital ELISA assay using single molecule array technology and surface plasmon resonance. Our results show that i) none of the antibodies tested are specific for one particular type of α-syn species, including monomers, oligomers or fibrils; ii) all antibodies that were reported to be oligomer-specific also recognized fibrillar α-syn; and iii) a few antibodies showed high specificity for oligomers and fibrils but did not bind to monomers. These findings suggest that the great majority of α-syn aggregate-specific antibodies do not differentiate between oligomers and fibrils, thus highlighting the importance of exercising caution when interpreting results obtained using these antibodies. Our results also underscore the critical importance of the characterization and validation of antibodies before their use in mechanistic studies and as diagnostic tools or therapeutic agents. This will not only improve the quality and reproducibility of research and reduce costs but will also reduce the number of therapeutic antibody failures in the clinic.

Türkçe çeviri

Makine çevirisi · Klinik kullanım öncesinde kaynakla karşılaştırılmalı.

Artan kanıtlar, alfa-sinüklein ( ⁇ -syn) oligomerlerin ⁇ -syn fibrilasyon ve Lewy vücut (LB) oluşumuna dahil olan yoldaki obligate ara maddeleri olduğunu ve ayrıca Parkinson hastalığı (PD) ve diğer sinükleinopatilerde LB'ler içinde birikebileceğini göstermektedir. Bu nedenle, ⁇ -syn oligomerlerini tespit etmek ve ölçmek için araç ve yöntemlerin geliştirilmesi, mekanik çalışmaların PD'deki rollerini anlaması ve PD ve diğer sinükleinopatiler için yeni teşhis yöntemleri ve terapiler geliştirmesi için giderek daha önemli hale gelmiştir. Bu araç ve yöntemlerin çoğunluğu öncelikle agregasyon durumuna özgü veya konformasyona özgü antikorların kullanımına dayanır. Bu antikorları kullanarak üretilen veri ve bilginin, ⁇ -syn ve PD araştırmalarının temelini ve yönlerini şekillendirmeye etkisi göz önüne alındığında, bu antikorların iyice karakterize edilmesi ve çeşitli ⁇ -syn türlerini yakalama özgüllüğünün veya yeteneklerinin test edilmesi ve doğrulanması çok önemlidir. Burada, ⁇ -syn antikorlarının özgüllüğünün, monomerler, fibriller ve farklı morfolojik, kimyasal ve ikincil yapı özellikleri ile karakterize edilen farklı oligomer preparatları dahil olmak üzere çeşitli ⁇ -syn türlerinin iyi tanımlanmış ve iyi karakterize edilmiş preparatlarını kullanarak sistematik bir şekilde araştırılmasını sağlayan bir antikor karakterizasyonu ve doğrulama boru hattını tanımlıyoruz. Bu boru hattı, 16'sı konformasyon veya oligomere özgü antikorlar olarak rapor edilen 18 ⁇ -sin antikorlarını karakterize etmek için kullanıldı, immünoblot analizi (slot blot ve Western blot), tek molekül dizi teknolojisi ve yüzey plazmon rezonansı kullanan dijital bir ELISA tahlili dahil olmak üzere bir dizi teknik kullanılarak. Sonuçlarımız, i) test edilen antikorların hiçbirinin, monomerler, oligomerler veya fibriller de dahil olmak üzere belirli bir ⁇ -syn türü için spesifik olmadığını; ii) oligomere özgü olduğu bildirilen tüm antikorların da tanınan fibriller ⁇ -syn olduğunu; ve iii) birkaç antikorun oligomerler ve fibriller için yüksek özgüllük gösterdiğini, ancak monomerlere bağlanmadığını göstermiştir. Bu bulgular, ⁇ -syn agregaya özgü antikorların büyük çoğunluğunun oligomerler ve fibriller arasında ayrım yapmadığını, böylece bu antikorlar kullanılarak elde edilen sonuçları yorumlarken dikkatli davranmanın önemini vurguladığını göstermektedir. Sonuçlarımız ayrıca, mekanik çalışmalarda kullanılmadan önce antikorların karakterizasyonunun ve doğrulanmasının ve teşhis araçları veya terapötik ajanlar olarak kritik önemini vurgulamaktadır. Bu sadece araştırmanın kalitesini ve tekrarlanabilirliğini artırmakla kalmayacak ve maliyetleri azaltacak, aynı zamanda klinikteki terapötik antikor arızalarının sayısını da azaltacaktır.

İlgili konular