The efficient generation of knockout microglia cells using a dual-sgRNA strategy by CRISPR/Cas9.

Araştırma özeti

Kaynak özetin Türkçe makine çevirisi. Klinik kullanım öncesinde özgün yayınla karşılaştırılmalı; hekim incelemesi değildir. cc by

Mikroglia'daki gen silme, özellikle son on yılda genom düzenleme için CRISPR / Cas9 sisteminin geliştirilmesinden sonra nöroinflamasyonu incelemek için önemli ve heyecan verici bir yaklaşım haline geldi. Bu çalışmada, CRISPR/Cas9 tarafından çift kısa kılavuz RNA (sgRNA) stratejisi kullanılarak yüksek verimli nakavt mikroglia hücreleri üretimi için bir protokol tanımladık. Leucine-zengin tekrar kinaz 2 (LRRK2), Parkinson hastalığının (PD) patojenik bir geni, hastalık gelişimi sırasında çok yönlü roller oynamıştır. LRRK2 çalışmaları ile ilgili birçok önemli kavrama rağmen, mikroglia ve nöroinflamasyonda LRRK2'nin normal ve hastalıkla ilgili işlevleri tam olarak araştırılmaya devam etmektedir. PD patogenezinde LRRK2'nin önemi göz önüne alındığında, protokolü LRRK2'yi hedeflemek için tasarladık ve uyguladık. Spesifik olarak, LRRK2'nin N terminusunu hedefleyen, 5' çevrilmemiş bölgeyi (UTR) ve ekson 1'i kapsayan iki sgRNA tasarladık ve tek hücreli genişleme ile nakavt hücrelerini taradık. Pratikte, çift sgRNA sistemi, nakavt hücrelerinin daha uygun, hızlı ve doğru bir şekilde elde edilmesini kolaylaştırabilir. Aday nakavt hücreleri, genomik PCR ile kolayca ayırt edilebilir ve farklı bant boyutlarına göre agaroz jelleri üzerinde çalışabilir. Başarılı nakavtlar Sanger sıralama ve Western blot ile daha da doğrulandı. Bu protokolü kullanarak, daha uzun hücresel süreçler, gelişmiş yapışma ve zayıflamış göç kapasitesi ile karakterize edilen LRRK2-deficient mikroglia hücre hattını elde ettik. Nakavt mikroglia, PD'nin geliştirilmesi ve ilerlemesinde LRRK2 işlevlerinin korunmuş ve yeni yönlerini ortaya çıkarmak için önemli bir hücresel araç olarak da hizmet edebilir. Çift sgRNA hedeflemeyi kullanan protokolümüz, %60 hedefleme verimliliğini garanti eder ve diğer genleri/lokusu, özellikle kodlamayan RNA'ları ve düzenleyici unsurları hedeflemek için de uygulanabilir.

Özgün kaynak özetini okuyun

Gene deletion in microglia has become an important and exciting approach for studying neuroinflammation, especially after the development of the CRISPR/Cas9 system for genome editing during the last decade. In this study, we described a protocol for the highly efficient generation of knockout microglia cells using a dual-short guide RNA (sgRNA) strategy by CRISPR/Cas9. Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), a pathogenic gene of Parkinson's disease (PD), has played versatile roles during the disease development. Despite many key insights into LRRK2 studies, the normal and disease-related functions of LRRK2 in microglia and neuroinflammation remain to be fully investigated. Given the importance of LRRK2 in PD pathogenesis, we designed and applied the protocol to target LRRK2. Specifically, we designed two sgRNAs targeting the N terminus of LRRK2, spanning the 5' untranslated region (UTR) and exon 1, and screened knockout cells by single-cell expansion. In practice, the dual-sgRNA system can facilitate in obtaining knockout cells in a more convenient, rapid, and accurate way. Candidate knockout cells can be easily distinguished by genomic PCR and running on agarose gels, based on the different band sizes. Successful knockouts were further verified by Sanger sequencing and Western blot. Using this protocol, we obtained an LRRK2-deficient microglia cell line, which was characterized by longer cellular processes, enhanced adhesion, and weakened migration capacity. The knockout microglia may further serve as an important cellular tool to reveal conserved and novel aspects of LRRK2 functions in the development and progression of PD. Our protocol using dual-sgRNA targeting guarantees > 60% targeting efficiency and could also be applied to targeting other genes/loci, especially non-coding RNAs and regulatory elements.

Bilimsel değerlendirme

Araştırma sorusu

Sorunun kapsamı orijinal çalışma üzerinden değerlendirilir.

Yöntem ve örneklem

Çalışma tasarımı ve örneklem için kaynak makaleyi kontrol edin.

Temel bulgular

Bu kayıt için editoryal olarak onaylanmış bulgu özeti henüz yayımlanmadı.

Sınırlılıklar

Sonuçların genellenebilirliği, yanlılık ve klinik anlamı ayrıca incelenmelidir.

Bibliyografik veriden yöntem, örneklem veya klinik sonuç çıkarımı yapılmaz.