[Enriching plasma exosomes for proteomic analysis using a phosphatidylserine-imprinted polymer].

Araştırma özeti

Kaynak özetin Türkçe makine çevirisi. Klinik kullanım öncesinde özgün yayınla karşılaştırılmalı; hekim incelemesi değildir. cc by

Ekzomlar, ana hücreden kaynaklanan büyük miktarda biyolojik olarak aktif madde taşıyan çoğu hücre tarafından salgılanan 40-160 nm veziküler nano-vücutlardır. Ekzozomlardaki proteinler, vücut sıvıları içindeki enzimler tarafından bozulmalarından koruyan fosfolipid çift katmanlı membranlar tarafından korunur. Nükleik asit, proteinler ve metabolitler ile birlikte ekzozozomlar, tümör belirteçlerini keşfetmek için en önemliler arasında kabul edilen biyomoleküllerdir. Plazma, klinik ortamlarda en çok kullanılan vücut sıvıları arasındadır; oldukça karmaşıktır ve ekzozozom izolasyonuna müdahale eden birçok protein ve metabolit içerir. Sonuç olarak, ekzozomları etkili bir şekilde izole etmek için yöntemlerin geliştirilmesi, klinik araştırmalarda kullanılmadan önce önemli bir zorluktur. Bu çalışmada, plazma ekzomlarını zenginleştirmek için fosfatidilserin moleküler olarak baskılanmış polimer (PS-MIP) kullandık. CD9, TSG101 ve CD81 ekzozom belirteç proteinleri için daha sonraki immünoblotting analizleri, sinyallerin sadece 5 ml plazma kullanılarak tespit edilebileceğini ve böylece zenginleştirme protokolünün etkinliğini ve özgüllüğünü gösterdiğini gösterdi. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve nanoparçacık izleme analizi (NTA) verileri, zenginleştirilmiş veziküllerin eliptik veya fincan şeklindeki yapılarla 30-100 nm boyutunda olduğunu, ekzozomların morfolojisi ve parçacık-boyut-dağıtım özelliklerine uygun olduğunu, PS-MIP'in ekzomları başarılı bir şekilde izole edebildiğini öne sürdü. Nanoflow sitometrisi, çok açılı lazer saçılımı (MALS) sinyalinin %75,4'ünün PS-MIP zenginleştirilmiş ekzozozomlardan türediğini ortaya koydu; bu da, bu zenginleştirilmiş ekzomların, ekzozomlara benzer boyuttaki agrega protein parçacıkları gibi safsızlıklardan son derece saf ve parazitsiz olduğunu göstermektedir. Bu yöntem, üç pankreas kanseri hastası ve üç sağlıklı gönüllüden klinik plazma örneklerinin proteomlarını ve potansiyel ekzozomal protein belirteçlerini analiz etmek için kullanıldı. Sağlıklı gönüllülerin plazma eksozomlarında toplam 1052 protein ve 4545 peptid tespit edildi, pankreas kanseri hastalarının plazma eksozomlarında toplam 972 protein ve 4096 peptid tespit edildi. Daha ileri biyoinformatik analizler, Vesiclepedia veritabanının PS-MIP yöntemi kullanılarak izole edilen plazma ekzomlarında tanımlanan proteinlerin %84'ünü kapsadığını ortaya koydu; Bu proteinler, ExoCarta veritabanında en sık tespit edilen 100 ekzomal proteinin 77'sini oluşturmaktadır. Hücresel bileşenlerden tanımlanan proteinler, esas olarak ekzozomlardan türediklerini ortaya koyan gen ontolojisi (GO) analizine tabi tutuldu, böylece plazma ekzomlarını zenginleştirmek ve daha sonraki tümör işaretleyici taraması için özgüllük sağlamak için PS-MIP yönteminin yüksek seçiciliğini gösterdi. Etiketsiz kantitatif analizler, 11 proteinin upregüle edildiğini ve 24 proteinin pankreas kanseri hastalarının plazma ekzomlarında sağlıklı gönüllülerinkine kıyasla azaldığını gösterdi. Pankreas kanseri olan hastaların plazma ekzomlarındaki yüksek derecede ifade edilen ve düşük ifade edilen proteinler GO'ya tabi tutuldu, bu da metabolik ve biyolojik süreçlerin pozitif düzenlenmesi ile ilgili yüksek ifade edilen proteinlerin, sağlıklı gönüllülerinkine kıyasla pankreas kanseri olan hastaların plazma ekzomlarında bulunduğunu gösterdi, oysa en önemli ölçüde az ifade edilen proteinler bağışıklık sistemi ile ilgili süreçlerdir, bunu uyaran yanıt veren, çok hücreli biyoişlemler, biyoregülatör ve progatif izler. Protein-protein etkileşim ağları (PPI) analizi ile nispeten yüksek oranda ilişkili olan ilk üç proteinin tamamlayıcı faktör D (CFD), tamamlayıcı bileşen 3 (C3) ve von Willebrand faktörü (VWF) olduğu belirlendi. Pankreas kanseri olan hastaların eksozomlarında, ekzosin benzeri glikosiltransferaz 2 (EXTL2), 1 (A2ML1) gibi alfa-2-makroglobulin ve Parkinson hastalığı proteini 7 (PARK7) en belirgin şekilde aşırı eksprese edildi. Bu nedenle, bu proteinler pankreas kanserinin tanısal ve prognostik değerlendirmesi için potansiyel biyobelirteçlerdir ve pankreas kanseri ile ilgili daha fazla klinik çalışma için destek sağlayabilir.

Özgün kaynak özetini okuyun

Exosomes are 40-160 nm vesicular nano-bodies secreted by most cells that carry large amounts of biologically active substances originating from the parent cell. Proteins in exosomes are protected by phospholipid bilayer membranes that protect them from degradation by enzymes within body fluids. Along with nucleic acid, proteins and metabolites, exosomes are biomolecules that are considered to be among the most important for discovering tumor markers. Plasma is among the most commonly used body fluids in clinical settings; it is highly complex and contains many proteins and metabolites that interfere with exosome isolation. Consequently, the development of methods for effectively isolating exosomes is a key challenge prior to their use in clinical research. In this study, we used a phosphatidylserine molecularly imprinted polymer (PS-MIP) to enrich plasma exosomes. Subsequent immunoblotting analyses for the CD9, TSG101, and CD81 exosome marker proteins showed that signals can be detected using only 5 μL of plasma, thereby demonstrating the efficiency and specificity of the enrichment protocol. Transmission electron microscope (TEM) and nanoparticle tracking analysis (NTA) data revealed that the enriched vesicles are 30-100 nm in size with elliptical or cup-shaped structures, consistent with the morphology and particle-size-distribution characteristics of the exosomes, suggesting that PS-MIP is capable of successfully isolating exosomes. Nanoflow cytometry revealed that 75.4% of the multi-angle laser scattering (MALS) signal is derived from the PS-MIP-enriched exosomes, which indicates that these enriched exosomes are highly pure and free of interference from impurities, such as aggregated protein particles that are similar in size to the exosomes themselves. This method was used to analyze the proteomes and potential exosomal protein markers of clinical plasma samples from three pancreatic-cancer patients and three healthy volunteers. A total of 1052 proteins and 4545 peptides were identified in the plasma exosomes of healthy volunteers, with a total of 972 proteins and 4096 peptides identified in the plasma exosomes of the pancreatic-cancer patients. Further bioinformatics analyses revealed that the Vesiclepedia database covered 84% of the proteins identified in the plasma exosomes isolated using the PS-MIP method; these proteins comprise 77 of the 100 most frequently identified exosomal proteins in the ExoCarta database. The identified proteins from the cellular components were subjected to gene ontology (GO) analysis, which revealed that they are mainly derived from the exosomes, thereby demonstrating the high selectivity of the PS-MIP method for enriching plasma exosomes and providing specificity for subsequent tumor-marker screening. Label-free quantitative analysis showed that 11 proteins were upregulated and 24 proteins were downregulated in the plasma exosomes of patients with pancreatic cancer compared to those of healthy volunteers. The highly expressed and lowly expressed proteins in the plasma exosomes of patients with pancreatic cancer were subjected to GO, which showed that highly expressed proteins related to the positive regulation of metabolic and biological processes were found in the plasma exosomes of patients with pancreatic cancer compared to those of healthy volunteers, whereas the most significantly under-expressed proteins are related immune-system processes, followed by stimulus-responsive, multicellular bioprocesses, bioregulatory, and interspecies-interacting biological-process-related proteins. The top three proteins, which are relatively highly correlated through protein-protein interaction networks (PPI) analysis, were determined to be complement factor D (CFD), complement component 3 (C3), and von Willebrand factor (VWF). Among the upregulated proteins in the exosomes of patients with pancreatic cancer, exostosin-like glycosyltransferase 2 (EXTL2), α-2-macroglobulin like 1 (A2ML1), and Parkinson's disease protein 7 (PARK7) were the most significantly overexpressed. Hence, these proteins are potential biomarkers for the diagnostic and prognostic assessment of pancreatic cancer and may provide support for further clinical studies into pancreatic cancer.

Bilimsel değerlendirme

Araştırma sorusu

Sorunun kapsamı orijinal çalışma üzerinden değerlendirilir.

Yöntem ve örneklem

Çalışma tasarımı ve örneklem için kaynak makaleyi kontrol edin.

Temel bulgular

Bu kayıt için editoryal olarak onaylanmış bulgu özeti henüz yayımlanmadı.

Sınırlılıklar

Sonuçların genellenebilirliği, yanlılık ve klinik anlamı ayrıca incelenmelidir.

Bibliyografik veriden yöntem, örneklem veya klinik sonuç çıkarımı yapılmaz.