NeuralCipher Araştırma özeti
Kaynak özetin Türkçe makine çevirisi. Klinik kullanım öncesinde özgün yayınla karşılaştırılmalı; hekim incelemesi değildir. cc by
Arka planDüşük frekanslı heteroplazmik mitokondriyal DNA (mtDNA) varyantları, Parkinson hastalığı (PD) da dahil olmak üzere yaşlanma ve nörolojik hastalıklarla ilişkilidir. PacBio HiFi uzun okuma kullanarak hedeflenen derin mtDNA dizilemesi, tam mitokondriyal genom boyunca heteroplazmiyi yüksek doğrulukla çözme potansiyeline sahiptir.MtDNA heteroplazmi tespit etmek için Vega PacBio dizilimini doğrulamak için, iki mtDNA haplotipinin önceden tanımlanmış dört karışımını analiz ettik. Tüm mitokondriyal genomu kapsayan tek bir uzun menzilli PCR amplikon ürettik. Bu amplikonlar önceden tanımlanmış oranlarda (minör karışım haplotip bileşeni:% 5,% 2,% 1 ve% 0.1) karıştırıldı. Mutserve2 kullanılarak değişken çağrı gerçekleştirildi ve doğruluk, F1 puanının beklenen ve tespit edilen varyantlar arasındaki karşılaştırmalardan hesaplanarak değerlendirildi. Tam uzunlukta mtDNA PacBio dizilimi, beş LRRK2 p.Gly2019Ser varyant taşıyıcısından türetilen fibroblast pasajları boyunca heteroplazmiyi araştırmak için uygulandı (n = 3 PD ve n = 2 etkilenmemiş taşıyıcılardan etkilenir). mtDNA heteroplazmi düzeyindeki değişiklikler ve varyant yükü, doğrusal bir karışık model kullanılarak uzunlamasına olarak değerlendirildi.SonuçlarTek amplikon yaklaşımı, üst üste binen PCR stratejileri ile ilişkili amplifikasyon önyargısı olmadan tam uzunlukta haplotip çözünürlüğü sağladı. Önceden tanımlanmış karışımların F1 skoru %5 ile %1 arasındaki heteroplazmi seviyeleri için 1.0 idi ve %0.1'de yüksek (0.91) olarak kaldı. %0,1 karışıma uygulanan özel olarak düşürülmüş çağrı eşiğinde, n = 10/62 Illumina referansı ile uyumsuz ek varyantlar gözlenmiştir, ancak duyarlılık bu karışımda 1.00'de çok yüksek kalmıştır. Tespit edilen küçük varyantlar beklenen heteroplazma seviyelerine yakından uyuyordu, ortalama varyant seviyeleri 0.057 (%5), 0.022 (%2), 0.011 (%1) ve 0.001 (%0.1) idi. On iki fibroblast pasajı boyunca, daha az mtDNA heteroplazmik varyant gözlemledik. Bu küçük ilkel kanıt deneyinde, heteroplazmik varyant yükü, etkilenmemiş (n = 3) ve etkilenmemiş (n = 2) LRRK2 varyant taşıyıcılarından daha yüksekti. Özellikle, heteroplazmik varyantların farklı kalıplarını gözlemledik.KonclusionPacBio HiFi dizilimi, tek bir amplikon stratejisi ile birleştirildiğinde, doğru tam uzunlukta mtDNA heteroplazmi tespiti ve boylamsal analiz sağlar, hastalıktaki mitokondriyal varyasyon ve dinamikleri incelemek için değerli bir araç sağlar.
Özgün kaynak özetini okuyun
BackgroundLow-frequency heteroplasmic mitochondrial DNA (mtDNA) variants are associated with aging and neurological diseases, including Parkinson's disease (PD). Targeted deep mtDNA sequencing using PacBio HiFi long reads has the potential to resolve heteroplasmy across the full mitochondrial genome with high accuracy.MethodsTo validate Vega PacBio sequencing for detecting mtDNA heteroplasmy, we analyzed four predefined mixtures of two mtDNA haplotypes. We generated a single long-range PCR amplicon covering the entire mitochondrial genome. These amplicons were mixed at predefined ratios (minor mixture haplotype component: 5%, 2%, 1%, and 0.1%). Variant calling was performed using Mutserve2, and accuracy was assessed by calculating the F1 score from comparisons between expected and detected variants. Full-length mtDNA PacBio sequencing was applied to explore heteroplasmy across fibroblast passages derived from five LRRK2 p.Gly2019Ser variant carriers (n = 3 affected with PD and n = 2 unaffected carriers). Changes in mtDNA heteroplasmy level and variant load were assessed longitudinally using a linear mixed model as a proof-of-principle.ResultsThe single-amplicon approach enabled full-length haplotype resolution without amplification bias associated with overlapping PCR strategies. The F1 score of the predefined mixtures was 1.0 for heteroplasmy levels between 5% and 1% and remained high (0.91) at 0.1%. At the specifically lowered calling threshold applied to the 0.1% mixture, n = 10/62 additional variants discordant with the Illumina reference were observed, but sensitivity remained very high at 1.00 in that mixture. Detected minor variants closely matched expected heteroplasmy levels, with average variant levels of 0.057 (5%), 0.022 (2%), 0.011 (1%), and 0.001 (0.1%). Across twelve fibroblast passages, we observed fewer mtDNA heteroplasmic variants. In this small proof-of-principle experiment, heteroplasmic variant load was higher in affected (n = 3) than in unaffected (n = 2) LRRK2 variant carriers and with older age. Notably, we observed distinct patterns of heteroplasmic variants that either increased or decreased in heteroplasmy level across passages.ConclusionPacBio HiFi sequencing, combined with a single-amplicon strategy, enables accurate full-length mtDNA heteroplasmy detection and longitudinal analysis, providing a valuable tool for studying mitochondrial variation and dynamics in disease.
Bilimsel değerlendirme
Araştırma sorusu
Sorunun kapsamı orijinal çalışma üzerinden değerlendirilir.
Yöntem ve örneklem
Çalışma tasarımı ve örneklem için kaynak makaleyi kontrol edin.
Temel bulgular
Bu kayıt için editoryal olarak onaylanmış bulgu özeti henüz yayımlanmadı.
Sınırlılıklar
Sonuçların genellenebilirliği, yanlılık ve klinik anlamı ayrıca incelenmelidir.
Bibliyografik veriden yöntem, örneklem veya klinik sonuç çıkarımı yapılmaz.