Efficient Isolation of Biofluid-Derived Exosomes Using Ammonium Sulfate: A Promising Alternative to Commercial Kits for Clinical Diagnostics

Araştırma özeti

Kaynak özetin Türkçe makine çevirisi. Klinik kullanım öncesinde özgün yayınla karşılaştırılmalı; hekim incelemesi değildir. cc by

Abstract Background and Objective: Ekzomlar nanoölçekli, lipit çift katmanlı veziküllerdir, hemen hemen tüm hücre tipleri tarafından salgılanır, çeşitli kökenlere ve bol moleküler yüklere sahiptir. Bu kombinasyon onları özellikle Alzheimer hastalığı (AD) ve Parkinson hastalığı (PD) gibi nörodejeneratif hastalıklar için invaziv olmayan tanı uygulamaları için son derece umut verici taşıyıcılar yapar. Bu hastalıkların patolojik lezyonlarının öncelikle merkezi sinir sisteminde (CNS) yoğunlaştığı göz önüne alındığında, erken ve doğru tanıya ulaşmak önemli bir zorluk oluşturmaktadır. Bununla birlikte, mevcut ekzozozom izolasyon yöntemleri - ultrasantrifügasyon, boyut dışlama kromatografisi, yoğunluk gradyan santrifüjleme ve ticari kitleri de dahil olmak üzere - doğal sınırlamalar ile yüzleşir. Bu yaklaşımlar genellikle hantal, zaman alıcıdır, yüksek maliyetler içerir ve aşağı akış deneysel süreçleri ciddi şekilde engelleyen artık reaktif bileşenlerin çıkarılmasındaki zorluk nedeniyle sıklıkla düşük saflık sağlar. Bu tür sınırlamalar, bu hastalıkların klinik tanısında ekzozomların uygulanmasını engeller. Bu nedenle, mevcut çalışma, yeni, uygun maliyetli ve verimli bir Amonyum sülfat (AS) bazlı eksozom yağış yöntemi geliştirmeyi ve nörodejeneratif hastalıkların teşhisinde potansiyel faydasını araştırmayı amaçlamaktadır. Yöntemler ve Sonuçlar: Amonyum sülfat konsantrasyonunu exozom yağışı için sistematik olarak optimize ettik, sonuçta 2.66 M'yi optimal çalışma konsantrasyonu olarak tanımladık. Bu yöntem, tüm izolasyon sürecini yaklaşık 1,5 saatte tamamlayarak dikkat çekici zaman verimliliği gösterdi. Dahası, sadece 12000 g'da santrifüj gerektirir, klinik tanı senaryolarındaki pratikliğini önemli ölçüde arttırır. Potansiyel uygulama kapsamını genişletmek için, yöntemin diğer vücut sıvıları üzerindeki etkinliğini de test ettik ve 2.66 M konsantrasyonunun toplam ekzozomların tükürükten izole edilmesinde eşit derecede etkili olduğunu gördük. Ticari olarak mevcut olan ExoQuick kitine karşı karşılaştırmalı analizler, amonyum sülfat bazlı yağış yöntemimizin AD hastalarının plazmasından toplam ekzomların izole edilmesinde ve astrosit türevli ekzozomların saflaştırılmasında karşılaştırılabilir bir etkinlik elde ettiğini göstermiştir. Ayrıca, nanoparçacık izleme analizi (NTA), elektron mikroskobu ve kanonik ekzomal belirteçlerin (CD63, CD9, CD171) tespiti kullanılarak yapılan kapsamlı doğrulama, iki izolasyon yönteminin fonksiyonel eşdeğerliğini doğruladı. Sonuç: Bu çalışmadan elde edilen kümülatif kanıtlar, amonyum sülfat bazlı eksozom izolasyon protokolünü, ticari olarak temin edilebilen kitlere uygulanabilir ve sağlam bir alternatif olarak sağlam bir şekilde kurar. Bu yöntem üç farklı avantaj sunar: Geliştirilmiş temporal verimlilik, azaltılmış maliyet yükü ve aşağı akış tahlilleri ile minimum müdahale, klinik uygulamaya son derece uygun hale getirir. Özellikle, klinik tanıda yaygın olarak kullanılan geleneksel bir biyoakışkan olan plazmadan ekzozomların etkili bir şekilde izole edilmesini ve ayrıca invaziv olmayan ve kolayca erişilebilir bir örnek matris olan tükürükten de sağlar. Bu özellikler, yöntemin nörodejeneratif bozuklukların erken tespitinde ilerleme potansiyelinin altını çiziyor. İleriye bakıldığında, bu yaklaşımın çok yönlülüğü, çeşitli biyolojik örnekler arasında uygulanabilirliğini öne sürüyor, böylece ekzozozom tabanlı tanısal araştırma ve klinik uygulamanın genişlemesini kolaylaştırıyor.

Özgün kaynak özetini okuyun

Abstract Background and Objective: Exosomes are nanoscale, lipid bilayer vesicles secreted by nearly all cell types, possessing diverse origins and abundant molecular cargo. This combination makes them exceptionally promising carriers for non-invasive diagnostic applications—particularly for neurodegenerative diseases like Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Given that the pathological lesions of these diseases are primarily concentrated in the central nervous system (CNS), achieving early and accurate diagnosis poses a significant challenge. However, existing exosome isolation methods—including ultracentrifugation, size exclusion chromatography, density gradient centrifugation, and commercial kits—face inherent limitations. These approaches are often cumbersome, time-consuming, involve high costs, and frequently yield low purity due to the difficulty in removing residual reagent components, which severely hampers downstream experimental processes. Such limitations hinder the application of exosomes in the clinical diagnosis of these diseases. Therefore, the present study aims to develop a novel, cost-effective, and efficient Ammonium sulfate (AS)-based exosome precipitation method and investigate its potential utility in the diagnosis of neurodegenerative diseases. Methods and Results: We systematically optimized the ammonium sulfate concentration for exosome precipitation, ultimately identifying 2.66 M as the optimal working concentration. This method demonstrated remarkable time efficiency, completing the entire isolation process in approximately 1.5 hours. Furthermore, it only requires centrifugation at 12000 g, significantly enhancing its practicality in clinical diagnostic scenarios. To expand its potential application scope, we also tested the method's efficacy on other bodily fluids and found that the concentration of 2.66 M was equally effective in isolating total exosomes from saliva. Comparative analyses against the commercially available ExoQuick kit demonstrated that our ammonium sulfate-based precipitation method achieved comparable efficacy in isolating total exosomes from the plasma of AD patients and in purifying astrocyte-derived exosomes. Furthermore, comprehensive validation using nanoparticle tracking analysis (NTA), electron microscopy, and detection of canonical exosomal markers (CD63, CD9, CD171) confirmed the functional equivalence of the two isolation methods. Conclusion: The cumulative evidence from this study firmly establishes the ammonium sulfate-based exosome isolation protocol as a viable and robust alternative to commercially available kits. This method confers three distinct advantages: enhanced temporal efficiency, reduced cost burden, and minimal interference with downstream assays, rendering it highly amenable to clinical implementation. Notably, it enables the effective isolation of exosomes from plasma, a conventional biofluid widely utilized in clinical diagnostics, as well as from saliva, a non-invasive and easily accessible sample matrix. These attributes underscore the method's potential in advancing the early detection of neurodegenerative disorders. Looking ahead, the versatility of this approach suggests its applicability across a diverse array of biological specimens, thereby facilitating the expansion of exosome-based diagnostic research and clinical practice.

Bilimsel değerlendirme

Araştırma sorusu

Sorunun kapsamı orijinal çalışma üzerinden değerlendirilir.

Yöntem ve örneklem

Çalışma tasarımı ve örneklem için kaynak makaleyi kontrol edin.

Temel bulgular

Bu kayıt için editoryal olarak onaylanmış bulgu özeti henüz yayımlanmadı.

Sınırlılıklar

Sonuçların genellenebilirliği, yanlılık ve klinik anlamı ayrıca incelenmelidir.

Bibliyografik veriden yöntem, örneklem veya klinik sonuç çıkarımı yapılmaz.