NeuralCipher Araştırma özeti
Kaynak özetin Türkçe makine çevirisi. Klinik kullanım öncesinde özgün yayınla karşılaştırılmalı; hekim incelemesi değildir. cc by
CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanan izojenik indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) hatlarının üretimi, değişken verimlilikle teknik olarak zorlu, zaman alıcı bir süreçtir. Burada biallelik CRISPR-Cas9 düzenlenmiş tek hücreli iPS klonlarını yüksek verimli 96 iyi mikrotiter plakalarına ayırmak için floresan aktive edilmiş hücre sıralamasını (FACS) kullanıyoruz. Yüksek içerikli tarama (HCS) teknolojisini kullandık ve sürekli genişleme ve doğrulama için doğru düzenlenmiş izojenik klonları seçmek için kurum içi geliştirilmiş bir algoritma oluşturduk. Modelimizde, otozomal dominant kalıtsal heterozigot c.88G>C mutasyonunu taşıyan bir Parkinson hastalığının (PD) iPSC'lerini gen düzelttik, bu da alfa-sinüklein proteininin patojenik p.A30P formuna yol açar. Sıralamadan önce PCR kısıtlaması-ciddi aracılı klonal seçim stratejisini kabul ederek, dörtlü tarama stratejisi kullanarak her izojenik klonu onaylayabildik. mRNA kodlaması eksizyon sadece transpoza sahip sonraki transfeksiyon, ayak izi içermeyen izojenik iPSC hatlarının üretilmesine izin verir. Bu monoklonal izojenik iPSC çizgileri normal bir moleküler genotipi korur, pluripotens işaretleyicilerini ifade eder ve üç germ katmanına ayırt etme yeteneğine sahiptir. FACS, HCS ve post-sortlu restriksiyon sindiriminin bu birleştirici yaklaşımı, hastalık modellemesinin otomatik bir platformda ölçeklendirilmesi için izojenik hücre hatlarının üretilmesini kolaylaştırır.
Özgün kaynak özetini okuyun
The generation of isogenic induced pluripotent stem cell (iPSC) lines using CRISPR-Cas9 technology is a technically challenging, time-consuming process with variable efficiency. Here we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to sort biallelic CRISPR-Cas9 edited single-cell iPS clones into high-throughput 96-well microtiter plates. We used high-content screening (HCS) technology and generated an in-house developed algorithm to select the correctly edited isogenic clones for continued expansion and validation. In our model we have gene-corrected the iPSCs of a Parkinson’s disease (PD) patient carrying the autosomal dominantly inherited heterozygous c.88G>C mutation in the SNCA gene, which leads to the pathogenic p.A30P form of the alpha-synuclein protein. Undertaking a PCR restriction-digest mediated clonal selection strategy prior to sequencing, we were able to post-sort validate each isogenic clone using a quadruple screening strategy. Subsequent transfection with mRNA encoding excision-only transposase allows for the generation of footprint-free isogenic iPSC lines. These monoclonal isogenic iPSC lines retain a normal molecular genotype, express pluripotency markers and have the ability to differentiate into the three germ layers. This combinatory approach of FACS, HCS and post-sorted restriction digestion facilitates the generation of isogenic cell lines for disease modelling to be scaled-up on an automated platform.
Bilimsel değerlendirme
Araştırma sorusu
Sorunun kapsamı orijinal çalışma üzerinden değerlendirilir.
Yöntem ve örneklem
Çalışma tasarımı ve örneklem için kaynak makaleyi kontrol edin.
Temel bulgular
Bu kayıt için editoryal olarak onaylanmış bulgu özeti henüz yayımlanmadı.
Sınırlılıklar
Sonuçların genellenebilirliği, yanlılık ve klinik anlamı ayrıca incelenmelidir.
Bibliyografik veriden yöntem, örneklem veya klinik sonuç çıkarımı yapılmaz.